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细胞/细菌总RNA提取试剂盒图片
产品货号:
WH0060
中文名称:
细胞/细菌总RNA提取试剂盒
英文名称:
Total RNA Extraction Kit from Cultured Cells/Bacteria
产品规格:
50次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本试剂盒采用高效、专一结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲系统,可从各种类型的培养细胞中快速提取总RNA,可同时处理大量不同样品。30-40分钟内即可完成反应,提取的总RNA纯度极高,没有蛋白质和其他污染。

产品特点:
·针对培养细胞和细菌独特配置,操作更简单、流程更优化。
·配有高效的DNaseⅠ,可有效去除DNA污染。
·配有CS过滤柱,可有效去除其它杂质。RNA纯度更高,无杂质残留,特别适合于对纯度要求很高的下游实验。
·操作安全可靠,无需酚/氯仿抽提,无需氯化铯梯度离心,无需氯化锂或乙醇沉淀。

下游应用:
· RT-PCR
· Northern blot、Dot blot
· Real-time RT-PCR
·芯片分析
· polyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆

提取实例:

培养细胞总RNA提取试剂盒实例
本试剂盒提取Human Jurkat Cells(1×106)的总RNA。洗脱体积50μl,RNA上样量2~4μl,1%琼脂糖凝胶,6V/cm电泳30min。

大肠杆菌总RNA提取试剂盒实例
本试剂盒提取大肠杆菌TOP10(1×108)的总RNA。洗脱体积50μl,RNA上样量2~4μl,1%琼脂糖凝胶,6V/cm电泳30min。

试剂盒组成:
组分50T
裂解液RL30ml
去蛋白液RW140ml
漂洗液RW12ml
RNase-Free ddH2O(瓶装)15ml
RNase-Free吸附柱CR3(含2ml收集管)50套
RNase-Free过滤柱CS(含2ml收集管)50套
DNaseI1500U
缓冲液RDD4ml
RNase-Free ddH2O(管装)1ml
RNase-Free离心管(1.5ml)50个

储存条件:室温保存,RNase-Free DNase I,缓冲液RDD和RNase-Free ddH2O(管装)置于2-8℃保存;加入β-巯基乙醇的裂解液RL 4℃可放置一个月;

自备试剂:β-巯基乙醇、无水乙醇、溶菌酶(WH0218,细菌RNA提取可选)

预防RNase污染,应注意以下几方面:
1.经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。
2.使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3.RNA在裂解液RL中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h,塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase。
4.配制溶液应使用无RNase的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.1%(V/V),放置过夜,高压灭菌。)

不同种细胞的最大用量及RNA得率:
细胞种类最大用量最大用量时RNA得率
COS3×106多至35μg
Hela7×106多至15μg
NIH/3T31×107多至10μg


使用前注意事项:
1.操作前在RL中加入β-巯基乙醇至终浓度为1%,如1ml RL中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RL 4℃可放置一个月,裂解液RL在储存时可能会形成沉淀,如果有沉淀出现,请加热溶解后使用。
2.第一次使用前应在漂洗液RW中加入无水乙醇,加入量请参见瓶上标签。
3.以下操作如非指明,均在室温下进行。

DNase I储存液的配制:
将DNase I干粉(1500U)溶解在550 μl RNase-Free ddH2O中,轻柔混匀,分装后-20℃贮存(可保存9个月)。
注意:从-20℃融化后的DNase I储存液保存于4℃(可保存6周),不要再次冻存。

操作步骤:

一、从培养细胞中提取总RNA
1.收集细胞:
  悬浮细胞的收集(收集细胞数量请不要超过1×107):估计细胞数量,300×g离心5 min,将细胞收集到离心管中,仔细吸除所有培养基上清。
  单层贴壁细胞的收集(收集细胞数量请不要超过1×107):可直接在培养容器中裂解(容器直径不超过10cm),或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。(在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法。)
  1)直接裂解法:确定细胞数量,彻底吸除细胞培养基上清,立即进行第2步裂解步骤。
  2)胰蛋白酶处理法:确定细胞数量,吸除培养基,用PBS洗涤细胞,吸除PBS,向细胞中加入含有0.10-0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞,当细胞脱离容器壁时,加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶,将细胞溶液转移至RNase-Free的离心管中,300×g离心5 min,收集细胞沉淀,仔细吸除所有上清。
  注意:收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净,否则会导致裂解不完全,影响RNA与吸附柱的结合,造成RNA的产量降低。
2.裂解处理
  对于离心得到的细胞沉淀:轻弹离心管底部,使细胞沉淀松散,加入适量裂解液RL(见下表,使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇),旋涡震荡。
沉淀细胞数量裂解液RL
<5×106350μl
5×106~1×107600μl

  对于直接裂解的细胞:RL(见下表,使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇),将细胞裂解液转移至离心管中,涡旋震荡混匀。
容器直径裂解液RL
<6cm350μl
6~10cm600μl

3.将所有溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中),12000rpm(~13400×g)离心2 min,收集滤液。
4.向滤液中加入1倍体积70%乙醇(通常为350 μl或600 μl),混匀(此时可能会出现沉淀),得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱CR3放入收集管中),12,000rpm (~13400×g )离心30-60 sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CR3放回收集管中。
  注意:配制70%乙醇时请使用RNase-Free ddH2O,如果滤液体积有所损失,请相应减少70%乙醇用量。将溶液和沉淀转移至吸附柱CR3时,如果体积大于吸附柱容量,可以分两次完成。
5.向吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1,12000rpm(~13400×g)离心30-60 sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CR3放回收集管中。
6.DNase I工作液的配制:取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中,加入70 μl RDD溶液,轻柔混匀。
7.向吸附柱CR3中央加入80 μl的DNase I工作液,室温放置15 min。
8.向吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1,12000rpm(~13400×g)离心30-60 sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CR3放回收集管中。
9.向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW (使用前请先检查是否已加入乙醇),室温静置2 min,12000rpm(~13400×g)离心30-60 sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CR3放回收集管中。
10.重复步骤9。
11.12000rpm(~13400×g)离心2 min,倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意:此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,离心后将吸附柱CR3在室温放置片刻,以充分晾干。如果有漂洗液残留,可能会影响后续的RT等实验。
12.将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中,加入30-100 μl RNase-Free ddH2O室温放置2 min,12000rpm(~13400×g)离心2 min,得到RNA溶液。
  注意:洗脱缓冲液体积不应少于30 μl,体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。

二、从细菌中提取总RNA
1.4℃12000rpm(~13400×g)离心2 min收集菌体(收集菌体的最大量不超过1×109),仔细去除所有培养基上清,以后的所有离心步骤均在室温(20-25℃)进行。
  注:如果培养基上清去除不完全,将对第二步中的细胞壁消化过程产生抑制。
2.用含有溶菌酶的100 μl TE缓冲液(客户自己配制,配制方法见下表)彻底重悬菌体,孵育时间见下表。
TE缓冲液中的溶菌酶终浓度孵育时间(室温)
革兰氏阴性细菌400μg/ml3-5 min
革兰氏阳性细菌3mg/ml5-10min

3.加入350 μl裂解液RL(在使用前请加入β-巯基乙醇),涡旋振荡混匀,若出现不溶性沉淀,12000rpm(~13400×g)离心2 min,将上清转移至另一离心管中。
4.加入250 μl无水乙醇,混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中),12000rpm(~13400×g)离心30-60 sec,倒掉废液,将吸附柱CR3放回收集管中。
5.向吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1,12000rpm(~13400×g)离心30-60 sec,弃废液,将吸附柱放回收集管中。
6.DNase I工作液的配制:取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中,加入70 μl RDD溶液,轻柔混匀。
7.向吸附柱CR3中央加入80 μl的DNase I工作液,室温放置15 min。
8.向吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1,12000rpm(~13400×g)离心30-60 sec,弃废液,将吸附柱放回收集管中。
9.向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇),室温放置2 min,12000rpm(~13400×g)离心30-60 sec,倒掉废液,将吸附柱CR3放回收集管中。
10.重复步骤9。
11.12000rpm(~13400×g)离心2 min,倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意:此步骤目的是将吸附柱CR3中残余的漂洗液去除,漂洗液的残留,可能会影响后续的RT等实验。
12.将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-Free ddH2O,室温放置2 min,12000rpm(~13400×g)离心2 min,得到RNA溶液。
  注意:洗脱缓冲液体积不应少于30 μl,体积过小影响回收效率。RNA溶液请在-70℃保存。
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